PCR (reakcija lanca polimeraze). Kako je dijagnoza PCR, indicije, kako se pripremiti za istraživanje, rezultati PCR

Za adekvatan i učinkovit u liječenju mnogih zaraznih bolesti mora biti pravovremeno utvrditi točnu dijagnozu. U rješavanju ovog problema danas uključeni high-tech dijagnostičkih metoda temelji se na metodama molekularne biologije. Trenutno je lančana reakcija polimeraze (PCR) već je naširoko koristi u medicinskoj praksi kao najpouzdaniji alat za laboratorijsku dijagnostiku.

Što račune za popularnost PCR u ovom trenutku?

Prvo, ova metoda se koristi za detekciju uzročnika raznih infekcijskih bolesti s visokom točnošću.

Drugo, pratiti učinkovitost liječenja.

U raznim priručnicima, brošure, članke i objašnjenja medicinskih stručnjaka, često smo suočeni s upotrebom opskurnim uvjetima i riječi. Doista je teško govoriti o high-tech proizvodi Science banalnim riječima.

Što je bit i mehanika dijagnostički PCR?

Svaki živi organizam ima svoje jedinstvene gene. Geni su raspoređeni u molekulu DNA, koja je zapravo „kartica” u svakom pojedinom organizma. DNA (genetski materijal) - vrlo dugo molekula koja se sastoji od „cigle” nazivaju nukleotida. Svaki pobudni leže strogo određene zarazne bolesti, tj u određenom slijedu i kombinacije. Kada je potrebno razumjeti da li osoba ima dano patogen, penje biološkog materijala (krv, mokraća, slina, bris), koji se sastoji od DNA ili DNA fragmenata mikrob. No, količina genetskog materijala patogena je vrlo mala, a to je nemoguće reći što je točno taj mikroorganizam on posjeduje. Kako bi riješio taj problem i služi kao PCR. Suština lančanoj reakciji polimeraze da je mala količina materijala se uzima za ispitivanje, koja sadrži DNA, PCR postupak je povećanje broja genetskog materijala koji pripada određenom patogena i na taj način, da se može prepoznati.

PCR dijagnostika - genetska studija biomaterial.

Ideja PCR pripada američkih znanstvenika K.Mullins, koju je predložio 1983. godine. Međutim, rasprostranjena klinička primjena je dobio tek u srednjem 90s XXveka.

Mi ćemo razumjeti terminologiju da je to - DNK, itd Svaka stanica svakog živog bića (životinje, biljke, ljudi, bakterija, virus) ima kromosom. Kromosomi - čuvari ova genetska informacija, koje obuhvaćaju cijeli slijed gena svakog pojedinog živog.

Svaki kromosoma je sastavljena od dva lanca DNK usukani u spiralu s obzirom na drugi. DNA - deoksiribonukleinska kiselina kemijski, koji se sastoji od strukturnih dijelova - nukleotida. 5 vrsta nukleotida - timin (T), adenozin (A), gvanin (G), citozin (C), te uracil (U). Nukleotidi su postavljene jedna iza druge u strogim redoslijedom pojedinih gena koji tvore. Jedan gen može sastojati od 20-200 nukleotida takvih. Na primjer, gen koji kodira za proizvodnju inzulina, sastoji se od 60 bp.

Nukleotidi su vlasništvo komplementarnosti. To znači da je suprotan adenin (A) u jednom lanca DNA potrebna je timin (T) na drugi lanac, a nasuprot gvanin (G) - citozina (C). Shematski kao što slijedi:
D - D
T - A
A - T
Ova tipka svojstvo komplementarnosti za PCR.

Osim DNA iste strukture RNA - ribonukleinske kiseline, koja se razlikuje od DNA u tome što je umjesto timina, uracil koristi u njemu. RNK - genetska informacija je skrbnik nekih virusa, pod nazivom retrovirusa (kao što su HIV).

       DNA i RNA molekule može „višestruko” (to svojstvo se koristi za PCR). To se događa kako slijedi: dva lanca DNA ili RNA, odstupiti od svake druge strane, svaka nit dobiva poseban enzim koji sintetizira novi lanac. Sinteza je princip komplementarnosti, odnosno, ako je u originalni DNA lanca nukleotida vrijednosti A, tada će se novo sintetiziran T, ako T - C zatim itd Ova posebna enzim „graditelj” u potrebi „sjeme” za početak sinteze - slijed nukleotida 5-15. Ovaj „sjeme” je definiran za svaki gen (gen klamidija, mikoplazme, virusa) eksperimentalno.

Tako svaka PCR ciklus sastoji se od tri koraka. Prvi korak se javlja tzv odmotavanje DNA - da je međusobno razdvajanje dva lanca DNA. U drugom - je „sjeme” veza na stranice DNA. Konačno, proširenje podataka molekule DNA, koja je izrađena fermentom- „graditelj”. Sada taj složeni proces odvija u jednoj cijevi, a sastoji se od ponavljajućih ciklusa reprodukcije definiran DNA za proizvodnju velikog broja kopija koji se zatim detektirati pomoću konvencionalnih postupaka. To je jedan od lanaca DNA smo dobili na stotine ili tisuće.

Faze PCR studija

Uzorkovanje biološkog materijala za istraživanje

Kao što je uzorak biološkog materijala različite, krv i njegove komponente, mokraća, slina, lučenje sluzi, cerebrospinalna tekućina, sekreti rana površine, sadržaja tjelesne šupljine. Biotestovi su svi instrumenti za jednokratnu sakupljen i biranih materijal zatvoren u sterilnim plastične cijevi ili stavljanjem medija kulture s naknadnim prijevoza do laboratorija.

Primljenih Uzorak se doda potrebna reagensa i staviti na programibilnom termostatom - termocikleru (thermal cycler). Thermocycler PCR ponavlja 30-50 puta ciklusa koji se sastoji od tri faze (denaturiranje, žarenja i produljenja). Što to znači? Razmislite detalje.

Faze zlouporabe PCR reakcija, kopiranje genetskog materijala

ja faza PCR - Priprema za kopiranje genetski materijal.
Odvija na temperaturi od 95 ° C, DNA niti se odvoje, a mogu sjediti „početnica”.

„Primeri” su proizvedeni industrijskim metodama razne znanstvene i industrijske udruge i laboratoriji kupiti gotove. „Sjeme” identificirati, kao što su klamidija, radi samo za klamidija, itd Tako, ako se biomaterial testira na prisutnost klamidijske infekcije, a zatim se reakcijska smjesa stavi „sjeme” za testiranje ako hlamidiy- biomaterial s Epstein-Barr virus, i „sjeme” za Epstein-Barr virus.

II faza - unija genetskog materijala infektivnog sredstva i „sjeme”.
Ako je DNA definiran pomoću virusa ili bakterije, „sjeme” sjedi na DNA. Proces ulaska „sjeme” je druga faza PCR. Ovaj korak odvija na temperaturi od 75 ° C

III faza - kopija genetskog materijala na infektivni agens.
Ovaj postupak je zapravo istezanja ili razmnožavanje genetskog materijala, koji se javlja kod 72 ° C Pod „sjeme” je pogodan enzim „graditelj” i sintetizira novi pramen DNA. Na kraju sinteze novog DNA lanac završava i PCR kruga. To jest, jedan broj PCR ciklusa povećava genetskog materijala dva puta. Na primjer, u izvornom uzorku imali 100 DNA molekule bilo kojeg virusa, nakon što je prvi ciklus PCR u uzorku će DNA molekule za 200 ispitivanog virusa. Ciklus traje 2-3 minute.

Za stvaranje dovoljne količine genetskog materijala identificiranja, općenito 30-50 ciklusa PCR su izvedene, koji traje 2-3 sata.

Red Identifikacija propagiraju genetski materijal

Zapravo PCR završava ovdje i dalje nema manje značajan stupanj identifikacije. Za identifikaciju metodom elektroforeze ili oznakom „početnica”. Kad se koriste za elektroforezu dobiveni DNK niti razdvojiti po veličini, a prisutnost DNA fragmenata različite dužine koja pokazuje pozitivan rezultat analize (tj prisutnost virusa, bakterija, itd.) Kada se koristi s oznakom „sjeme” je dodan kromogeni (boje) u konačni produkt reakcije, pri čemu je enzimska reakcija je popraćena formiranjem boje. Boja razvoj je direktan dokaz da su postojale u izvornom uzorku virus ili neki drugi sredstvo za otkrivanje.

Do danas, koristeći oznakom „primer”, kao i odgovarajući softver, moguće je proizvesti odjednom i „pročitati” rezultate PCR. To je tako nazyvaemayareal-time PCR.

Zašto PCR dijagnostiku ima tu vrijednost?

Jedan od značajnih prednosti metode PCR je visoka osjetljivost - 95 do 100%. Međutim, ove prednosti treba se temeljiti na uvijek sljedećim uvjetima:

1. ispravan uzorkovanja transportiranje biološkog materijala;
2. Dostupnost sterilnih jednokratnu instrumenata, specijaliziranim laboratorijima i obučenog osoblja;
3. strogo pridržavanje sterilne tehnike i tijekom analize

Osjetljivost varira za različite otkrivenim bakterija. Primjerice osjetljivost PCR metode za detekciju virusa hepatitisa C je 97-98%, osjetljivost detekcije Ureaplasma - 99-100%.

Mogućnosti svojstvene PCR analize, može postići bez premca analitički specifičnost. To znači da je identifikacija mikroorganizama je da gleda, a ne slične ili usko povezani.
Dijagnostički Osjetljivost i specifičnost metode PCR, često premašuju one za metodu za kulturu, pod nazivom „zlatnog standarda”, za detekciju infektivnih bolesti. S obzirom na trajanje rastuće kulture (od nekoliko dana do nekoliko tjedana), prednost PCR je evidentno.

PCR u dijagnozi infekcija
Prednosti postupka PCR (osjetljivosti i specifičnosti) definiraju širok spektar primjene u suvremenoj medicini.
Glavna primjena PCR dijagnostiku:

1. Dijagnoza akutne i kronične bolesti raznih zaraznih lokalizacije
2. praćenja učinkovitosti terapije
3. pojašnjenje vrste patogena

PCR koristi, ginekološka ginekologiji i neonatologiju i pedijatriji, Urology, Venereology, nefrologije, zarazne bolesti klinici, oftalmologija, neurologiji, Phthisiopneumology sur.

Pomoću PCR dijagnostika se provodi u kombinaciji s drugim metodama za istraživanje (ELISA, PIF, FIF et al.). Njihova kombinacija i određuje prikladnost liječnika.

infektivni agensi otkrivena je PCR postupkom

virusi:

1. Retrovirusa HIV-1 i HIV-2
2. herpetiformis virusi
3. Vrste virus herpes simpleks 1 i 2
4. citomegalovirus
5. Epstein-Barr virus
6. Varicella - zoster virus
7. humani herpes virus 6 i 7
8. hepatitis C, B i A
9. virusi, humani papiloma
10. virus rubeole
11. adenovirusi
12. rinovirusi
13. parvovirus
14. pikornovirusy

bakterije:

1. mikobakterije
2. klamidija
3. mikoplazme
4. salmonele
5. Legionella
6. klostridije
7. blijeda Treponema
8. Razne vrste patogene E.coli
9. Vibrio cholerae
10. rikecije
11. aurococcus
12.  uzročnik bakterijskog meningitisa
13. Helicobacter pylori
14. ureaplazma
15. gonoreja
16. difterije bacillus
17. Haemophilus influenzae

U ovom popisu su najčešći infektivni agensi otkriveni pomoću PCR. U stvari, ovaj popis je puno širi, stalno ažuriraju, kao sintetizirani novi „sjeme”. Također treba napomenuti da je popis identificiranih patogena određuje prisutnost „sjemena” za identifikaciju u arsenalu svakog pojedinog laboratorija.


Autor: AK Nasedkina