Imunosorbent testa (ELISA, ELISA). Suština načela metode i faze istraživanja. Analiza klasa antitijela antitijela, imuno kompleksa.

U vezi s razvojem mobilne tehnologije, molekularne biologije, genetike, fizike, kemije i mnoge druge high-tech disciplina u svakodnevnoj praksi uvođenja novih visoke preciznosti i high-tech metode. Ovi trendovi utječu i interdisciplinarno područje medicinskog znanja i srodnih područja bioloških, biokemijskih problema. široko rasprostranjena i uvođenje rasprostranjenog metode kliničke laboratorijske dijagnostike, pod nazivom enzimski imuno za posljednjih deset godina.

Općenito tehnologija imunoloških i enzimskih reakcija radiološki naširoko koristi u staničnoj tipkanje, staničnim kulturama različita tkiva, od početka 80-ih godina XX stoljeća. Međutim, ove metode su vrlo dugotrajan, nije jedinstvena, nije standardiziran, što zabranjeno njihovo korištenje u terapeutske i dijagnostičke svrhe u stado. Te metode koriste uski, high-tech i visoko specijalizirani laboratorij.

Međutim, s napretkom tehnologije, mikrotehnikom, proizvodnju raznih biopolimera materijale moguće proizvesti gotove setove ELISA dijagnostiku, koja će biti u mogućnosti koristiti laboratorij zdravstvenih ustanova generalist. ELISA je naširoko koristi za dijagnosticiranje različitih infekcija (klamidija, sifilis, citomegalovirus, herpes, toksoplazmoza, itd), i akutne i kronične, i latentnih oblika koji se pojavljuju bez kliničkih simptomov.Takzhe ovaj postupak se koristi za kontrolu kroničnog bolesti. Pokušajmo shvatiti što ova metoda je i što principi se temelje?

Komponente vezanog imunosorbenta testa - imunološki odgovor i enzimske reakcije

Imunohistokemija, kao što ime implicira, sastoji se od dvije različite komponente - imune reakcije i enzimske reakcije. Imunološki odgovor daje obvezujuće biološke molekule, stanice ili stanice mikroorganizama, koji su zapravo pokušavaju pronaći, a enzimska reakcija nam omogućuje vidjeti i izmjeriti rezultat imunološke reakcije. To je, imunološki odgovor - je dio složene tehnike, koja je zapravo detektira željeni mikrob. Enzimski reakcija - da je dio složene tehnike, što omogućuje prevesti rezultat imunog odgovora u obliku oka vidljivi i dostupni na mjerenje rutinskih kemijske tehnike. Na temelju takvih metoda struktura imunskoga, analiziramo obje strane odvojeno.

Imunološki odgovor je to? Što je antitijelo, antigen?

Što je imunološki odgovor? Što je antigen?
Prvo analizirati što je imunološka reakcija. imunološke reakcije - specifično vezujući reakcija antigen s antitijela kako bi se dobilo imunološki kompleks se. Što to znači? Na površini svake stanice od bilo kojeg organizma postoje posebne strukture nazivaju antigeni. Antigeni u cjelini - su molekule koje prenose informacije o stanici (kao informacija o značku u ljudi koji navodi osnovne podatke o osobi).

Individualni i specifične antigene - što je to? Zašto nam je potrebna ova antigene?

ima pojedinačne antigene, koji je jedinstven za ovaj organizam. Ovi pojedinačni antigeni su drugačiji od svih ljudi, ima slične jedna drugoj, ali ipak drugačiji. Dvije identične kopije pojedinih antigena ne postoje!

Drugi glavni tip antigena - je antigeni vrsta, koja je svojstvena određenim vrstama živih bića. Na primjer, osoba koja je prisutna specifični antigen koji je zajednički svim ljudima, miševima tu je mišje vrste antigena, itd Na površini svake stanice nužno predstaviti vrsta i individualni antigen.

Specifični antigen koristi imunih stanica priznanje. „- drugoga”

Kako je prepoznavanje antigena?

Imune stanice povezane sa sumnjivim stanice i nosi identifikacija o pojedinačnom antigen. Imunološki memorije „napisao” stanica izgleda kao „svog antigena.” Dakle, ako je antigen sumnjive stanice odgovara opisu „antigen”, to znači da stanica vlastitog tijela i nije ozbiljna. Tada je imuna stanica „odvezati” i odlazi. A ako antigen nije isto kao opis „A”, a imunih stanica identificira stanicu kao „strano” i stoga potencijalno opasno za cijeli organizam. U tom slučaju, imunološki stanica nije „odvezati” i počinje da uništi opasni objekt. Točnost takvih imunološkog prepoznavanja je nevjerojatna - 99,97%. praktički nema greške!

Što je antitijelo imunološki kompleks?
Što je antitijelo?

Antitijelo - posebna molekula nalazi na površini stanica imunološkog sustava. Da protutijelo se veže na antigen i sumnjivih stanica. Daljnje transferi antitijela informacije u stanicu, gdje priznavanje i prima povratni signal od dvije vrste „A” ili „protivnika”. Kad se signal „a” narušava antitijela komunikaciju s antigenom i oslobađa stanica.

Što je imuni kompleks?
Kada se signal „strano” situacija razvija drugačije. Protutijela ne prekinuti vezu s antigena, i obrnuto, slanjem određene signale, uzrokuje „pojačanje”. Biološki to znači da se i druga protutijela na drugi dio stanice počinju premjestiti u područje gdje se nalazi i signal za opasnost, i formiraju vezu između antigen i uhvaćen. Na kraju, antigen je okružen sa svih strana i čvrsto privyazan.Takoy antigen + antitijela nazvanih imuni kompleks. Od tog trenutka, na raspolaganju antigena. Ali sada detalji procesa neutralizacije antigen nas ne zanima.

Tipova antitijela (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Antitijelo - strukturu proteina, što redom imaju kemijski naziv, koji se koristi kao sinonim za ekspresiju protutijela. Dakle, antitijela imunoglobulini =.

Postoji pet vrsta imunoglobulina (Ig), koja se vežu na različite vrste antigena na različitim mjestima u tijelu (npr kože, sluzi, krvi, i tako dalje. d.). To je, antitijela imaju podjelu rada. Ovi se nazivaju imunoglobulini latinicu - A, M, G, D, E i označeni su kako slijedi: - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

U dijagnostici koristi samo jedna vrsta antitijela koja je specifična za najviše definirano mikroba. Da je vezanje antitijela su definirani s antigen uvijek događa. Najčešće korišteni IgG i IgM.

Ovaj princip imunološki odgovor (jedinstvena specifičnost i točnost prepoznavanja određena biološkog objekta) u pozadini imunoenzimnom analiza.V čvrstoće visoka preciznost antitijela koja prepoznaju antigene, točnost svih metoda imunskoga je također superiorniji.

Enzimatska reakcija

Što reakcija - enzim? Što je afinitet supstrata i proizvoda?
Sada razmislite enzimske reakcije u načinu enzim imunskoga.

Što je enzimska reakcija?

Enzimatska reakcija - kemijska reakcija u kojoj je jedna tvar prevodi enzimom na drugu. Tvar koja djeluje na enzim supstrat. Tvar koja se dobiva utjecajem enzima koji se zove reakcijski produkt. Naznačen time što je značajka enzimske reakcije je da neki enzim djeluje samo na određenom supstratu. Ova nekretnina enzima prepoznati „njihov” podloge zove sklonost.

Dakle, svaki enzim nosi samo jedan, specifičan odgovor na to. Enzimi u biološkom svijetu zna veliki izbor, kao i enzimske reakcije. ELISA dijagnostički koristi samo nekoliko enzimske reakcije - ne više od 10. Nakon toga su odabrani tako enzimska proizvod reakcije koja je obojana tvari. Zašto je enzimska reakcija proizvodi moraju se bojati? Budući da nema kemijske jednostavan postupak za izračunavanje koncentracije tvari u boji otopine - znanost o bojama.

Metoda o bojama - bit i načelo

znanost o bojama koristi mjerenje gustoće boje rješenja i od strane gustoće boje izračunate koncentracije veschestva.Pri ovaj poseban uređaj - kolorimetrom mjere boja gustoće otopine. U kolorimetrijski dvije moguće gustoće boje, ovisno o koncentraciji tvari - izravno je proporcionalna ovisnost ili obrnuto proporcionalni. U izravnom razmjeru, to je veća koncentracija tvari, intenzivniji gustoća boja otopine. Obrnuto proporcionalna je viša koncentracija tvari, niži je boja otopine gustoće. Tehnički, to se odvija na sljedeći način: uzeti nekoliko rješenja poznatih koncentracija tvari izmjerena gustoća tih rješenja, koncentracija je nacrtane na gustoću boje (graf kalibracija).

Zatim, mjerenje gustoće boje otopine, koncentracija koja se pojavljuje i kalibracija graf su vrijednosti koncentracija koja odgovara razini izmjerenih gustoća boje rastvora.V suvremenih automatskih colorimeters jednom kalibracija provodi, onda je sama jedinica konstruira kalibracijske krivulje koja ostaje u sjećanju i mjerenje automatski.

peroksidaza: imuno najčešće koristi sljedeće enzime alkalna fosfataza, avidin.

Kao kombinirani imunološke i enzimske reakcije u ELISA? Sada ćemo nastaviti u obzir stvarni enzimski imunološki test. Koji su stupnjevi to uključuje i ono što se događa kada te reakcije? Vezanog imunosorbentnog ispitivanja je izravne i neizravne.

Izravno vezanog imunosorbentnog ispitivanja - stupnjevi

U izravnom ELISA korištenjem antitijela za prepoznavanje antigena u kombinaciji s određenom oznakom. Ovaj oznaka je supstrat enzimatske reakcije.

Pričvršćivanje antigen na površinski antigen i spoj jažica antitijela

Kako izravna enzim imunotcst? Uzmi biološki materijal (krv, sluz izbrusaka razmazuje) i odložiti u posebne bunara. Biološki materijal ostaje u bunarima 15-30 minuta na antigene mogu staviti na površinu iz bunara. Nadalje, u ovim jažice se dodaje protutijela za otkrivanje antigena. To znači da se identificiraju antigene, kao što je sifilisa, dodan antitijela protiv antigena sifilisa. Ta antitijela se proizvode industrijskim metodama, te laboratorijska kupiti spreman nabory.Dannuyu mješavinu materijala i antitijela ostaviti za neko vrijeme (od 30 minuta do 4-5 sata), da antitijela su mogli naći i stupiti u kontakt s „njihove” antigenom.Chem više biološki antigeni uzorak, više kontakt antitijela s njima.

Uklanjanje „nepotrebne” antitijela

Kao što je spomenuto, antitijela također se odnose na specifične metkoy.Poskolku antitijela se dodaje u suvišku, nisu svi od njih će biti kontaktirani s antigenima, a ako nema antigena u uzorku, a zatim, u skladu s tim, ni antitijela ne kontaktira sa željenim antigenom. Za uklanjanje „Extra” antitijela, sadržaj bunara jednostavno izlije. Kao posljedica toga, sve „suvišak” antitijela su uklonjena, a one koje su povezane s antigenima kao antigeni „zalijepljen” na površini jažice. Jažice se ispere nekoliko puta s posebnim dodatkom koji vam omogućuje da prati sve „dodatne” antitijela.

Enzimatska reakcija - formiranje obojenog spoja

Potom slijedi druga faza - enzimsku reakciju. Isprane jažice doda se otopine enzima i ostavi da stoji 30-60 minuta. Ovaj enzim ima afinitet za tvar (specifična oznaka), koji je povezan s antitijelom. Reakcije enzima su izvedena kao čime ovaj oznaka (supstrat) se pretvara u obojeni tvari (proizvoda). Zatim postupak kolorimetrija da koncentracija u boji tvari. Budući da je ova specifična oznaka je povezana s protutijelom, potom koncentracija obojenog reakcijskog produkta koji je jednak koncentraciji antitijela. Koncentracija antitijela jednake koncentracije antigen. Dakle, kao rezultat analize, dobili smo odgovor, što je koncentracija otkrivene mikroba ili hormon.

To je ono što prolazi ravno imunosorbcnt testa. Danas, međutim, više vjerojatno da će koristiti neizravnu imunosorbcnt testa, jer je osjetljivost i točnost neizravna više nego direktna. Dakle, neka je posredni enzimski imuno.

Posredni enzimski imuno - stupnjevi

U neizravnih ELISA dvije faze. U prvoj fazi se koriste neobilježena antitijela na neku detektabilnu antigene, a u drugoj fazi se primjenjuje prva označenih antitijela obilježenih antitijela. Koji nije dobivena izravno vezanje antitijela na antigen, a dvostruko provjera: vezivanje antitijela na antigen, pri čemu je vezanje drugog antitijela kompleksa s protutijelom + antigen. Tipično, antitijela u prvom stupnju - miš, a za drugi - koze.

Učvršćenje antigena na površini jažice i vezanje antigena s neobilježenog antitijela
Baš kao i za izravnu imuno testom izvedena ograda biološkog materijala - krvne strugotina, razmazima. Ispitivan je biološki materijal doda se u jažice i pusti da stoji 15-30 minuta zbog vezanja na površinske antigene jažice. Zatim se jamice doprinose neobilježenih antitijela na antigene i ostavljena na vrijeme (1-5 sati), na protutijelo u kontakt sa „svojim” antigena i imunog kompleksa (prva faza). Zatim uklonite „višak”, nevezano protutijelo izlijevanjem sadržaj posudice. Ispire s posebnim dodatkom za potpuno uklanjanje svih ne-vezani antitijela.

Vezanje obilježenog antitijela na antigen, antitijelo + neobilježeni
Zatim uzeti drugog antitijela - označeni, dodaje se u jažice i opet ostavi da odstoji neko vrijeme - 15-30 minuta (Drugi dio). Tijekom tog vremena, obilježena protutijela vežu se na prvi - nije označen i formira kompleks - antitijelo antigen + + antitijela. Međutim, označiti i obilježena protutijela se unese u jažice u suvišku. Stoga je potrebno ponovno ukloniti „Extra”, već označena antitijela koja se ne vežu na neobilježeno protutijelo. Ovaj postupak se ponavlja za izlijevanje sadržaja zdenaca i pranje s posebnim rješenjem.

Enzimatska reakcija - formiranje obojenog spoja
Onda uvesti enzim je reakcija pretvorbe „oznaka” u boji tvari. Boja se razvija u roku od 5-30 minuta. Zatim se provodi kolorimetrijski te izračunavanje koncentracije obojene supstance. Budući da koncentracija u boji tvari je označen koncentracija protutijela, a koncentracija obilježivača je jednaka koncentraciji obilježenih antitijela, koji je pak jednak koncentraciji antigena. Tako dobivamo koncentraciju antigena može detektirati.
Kao dvojni kontrola pomoću dvije vrste antitijela poboljšane osjetljivosti i specifičnosti imunoenzimski testu. Unatoč produljenje vremena trajanja analize i uključivanje dodatnih koraka, ti gubici su izjednačena preciznost rezultat. Zato je u ovom trenutku velika većina enzima tehnikama imunološke - to je posredni enzimski imuno.

Što bolesti otkriven enzima imunološka dijagnostika?

Razmotrimo sada kakav bolesti i bilo koji biološki aktivnu tvar otkriti imuno testom. Tvari otkrivene enzimskim imunoispitivanjem prikazane su u tablici.


Tablica u nastavku nije potpun popis testova (samo najčešći), pomoću ELISA. Donesite cijeli popis nije moguće, jer će biti vrlo velika i stalno ažuriraju. Osim laboratorijske dijagnostike strane imuno testom to je naširoko koristi u znanstvenim istraživanjima.




Autor: AK Nasedkina